A népszerű Mario & Luigi szerepjáték sorozat negyedik része azzal veszi kezdetét, hogy Mario, Luigi, Peach hercegnő és kísérete meghívást kap a rejtélyes Pi’illo Szigetre az ugyancsak rejtélyes Dr. Snoozemoretól. A kellemes fogadtatást követően – amiről feltűnő módon hiányzik Dr. Snoozemore – a dolgok rossz fordulatot vesznek, mikor Peach Hercegnőt elrabolja és az Álomvilágba viszi a sorozat új gonosza, a kísérteties denevér király Antasma.
Peach Hercegnő és elrablója megtalálásához Marionak be kell lépnie az Álomvilágba az alvó Luigi álmain keresztül, akinek agya egy hullámhosszon van a Pi’illo Sziget lakóival, a Pi’illo Néppel. Luigi Álomvilága és a valós világ közt ingázva Marionak és Luiginak fejtörőket kell megoldania, ellenfeleket legyőznie és Luigi képzeletének szüleményeit használnia a továbbjutáshoz.
Az Álomvilág és a valós világ közötti kapcsolat fontos szerepet játszik a játékban. A valós világban a Pi’illo Szigeten kalandozva Marionak és Luiginak egyaránt jellegzetes Bros. Mozdulatait bevetve kell továbbjutnia, míg az Álomvilágban az erős Álom Luigi támogatja Mariot. Például a varázslatos Luiginary Works elemekkel a játékosok Luigi álombeli formáját a hasznukra fordítva juthatnak át az Álomvilágon. Luigi orrának vagy bajszának meghúzása a konzol alsó kijelzőjén a valós világban hatással van álombeli énjére is, ami így segíthet Mario kalandjaiban.
Az Álomvilágban zajló harcok során ugyancsak kapóra jön Álom Luigi ereje, a seregnyi Luigi segítségével ugyanis Mario képes látványos Luiginary Támadások bevetésére, amik egyedi módon használják ki a Nintendo 3DS készülékek funkcióit és nagyban eltérnek a valós világban bevethető jellegzetes Bros. Csapásoktól. Például az egyik Luiginary Támadás során Mario egy labdányi Luigin egyensúlyoz, miközben a játékos a konzol mozgásérzékelőjével irányítja a labdát és zúzza össze az ellenfeleket. Legyen szó támadásról, ellencsapásról vagy kitérésről a harcokban, a konzol 3D képességei ugyancsak elengedhetetlenek a tökéletes időzítéshez.
Minden nyertes csata után a klasszikus szerepjáték formulát követve megkapják a karakterek a szerzett tapasztalati pontjaikat, amiktől szintet lépve növelhetik értékeiket, mint például életerejüket vagy sebzésüket. Visszatérnek továbbá a sorozat korábbi részeiből ismerős, a különleges támadásokhoz szükséges Bro Pontok, illetve a STACHE is, ami hatással van Mario és Luigi kritikus találatainak esélyére. A kitűző jutalomrendszer ugyancsak visszatér, így a két testvér kitűzőket találhat vagy vehet, amiket aztán hasznos díjakra válthat be bizonyos feladatok – például egy „nagyszerű” támadás – elvégzése után a harcban. A kezdő játékosok számára a tippek, a könnyű mód és a lassú támadás mód segít beletanulni a harcokba.
